【貨號】 BC-C-RA-013

【規格】 1*10⁶個/T25培養瓶（或凍存管）

【保存】 液氮保存，長期

【產品介紹】

【操作步驟】

【細胞復蘇】

1、取出1mL凍存管后，迅速放入37℃水浴鍋中不斷搖晃使其解凍，直至凍存管中無結晶（此過程盡量在2min內完成）；

2、準備15mL離心管，加入2-6mL完培，將凍存管中的細胞懸液移至離心管，1000 rpm離心3~5min；（比較難養的細胞可適量增加離心管中的完培）

3、吸棄上清，用新鮮培養基重懸細胞，接種至無菌的培養器皿中，輕晃動混勻后放入37℃、5%CO₂細胞培養箱中培養。

注：復蘇第二天若細胞狀態較好，但漂浮碎片較多可做換液處理；

復蘇的細胞需要時間恢復狀態，當復蘇好后密度低于80%時，2天內暫時不要換液，細胞生長狀態恢復后再進行后續傳代等操作；

【細胞傳代】

當細胞匯合度達到80%-90%，即可傳代培養。

收集細胞：貼壁細胞可以參考以下方法1、吸去培養液，加入不含鈣鎂的PBS，輕輕潤洗瓶底1-2次，吸棄PBS；2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），鋪勻瓶底放入培養箱中消化1-2min；（部分細胞貼壁較牢，可采用分步消化：將消化下來的細胞轉移至離心管終止，在培養瓶中加入胰酶繼續消化，直至大部分細胞脫落）3、倒置顯微鏡下觀察大部分細胞變圓脫落，迅速加入完全培養基終止消化，完培與胰酶比例為2:1；4、輕輕吹打細胞后吸出轉移至離心管中。半貼壁半懸浮細胞需先收集懸液至離心管再參考貼壁細胞操作。

離心：收集好的細胞在1000rpm條件下離心3~5min，離心好后棄除上清液。

接種：準備好新的培養瓶并添加適量完全培養基，在離心管加入1-2mL完全培養基重懸吹打均勻，初次傳代將細胞懸液按1:2比例接種到新的培養瓶中，后續可根據細胞實際情況按1:2-1:4的比例傳代；接種完成后放入37℃、5%CO₂細胞培養箱中培養。

懸浮細胞建議采用半換液傳代：將培養瓶站立靜置5-10min，肉眼可見細胞沉底，吸取1/2~2/3上清至離心管離心，將瓶內剩余懸液按1:2或1:3的比例轉移至新的培養瓶，將離心管中的細胞重懸后放入培養瓶添加新鮮完全培養基即可。

【細胞凍存】

收集細胞參考細胞傳代步驟。

凍存液重懸：細胞按照傳代步驟收集細胞至離心管并計數，根據計數的密度決定細胞凍存數量，一般推薦細胞凍存密度為1×10⁶-1×10⁷個活細胞/管。離心后棄上清，加入配制好的凍存液重懸，分配到凍存管中，每管1mL。

凍存：將凍存管放入程序降溫盒中進行梯度降溫，然后放入-80℃冰箱降溫，24h后將凍存管轉入液氮罐中。若沒有凍存盒，可于冰箱4℃放置30min，隨后轉移至-20℃冷凍2h，接下來將其放于-80℃超低溫冰箱中過夜，最終放置于液氮中以長期保存。

【注意事項】

（1）所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全柜內操作，并注意防護。所有廢液及接觸過此細胞的器皿需滅菌后方能丟棄。

（2）若細胞在操作過程中發生污染，需對污染的細胞進行滅活方可丟棄。

（3）本庫的細胞系（株）僅用于科研工作，未經許可不得用于其他目的，使用者不得將本庫細胞系（株）轉讓給第三者。

（4）細胞到貨后建議在前3代時凍存一批細胞種子以備后續用。